Proliferazione epatocellulare ed apoptosi in relazione al danno ossidativo nelle epatopatie alcol-correlate

 

Riassunto  

Nelle patologie alcol-correlate, la produzione di radicali liberi può svolgere un ruolo importante nella patogenesi del danno epatico ed influenzare il turnover cellulare. Lo scopo di questo studio è stato di correlare i livelli di perossidazione lipidica, delle difese anti-ossidanti e del metabolismo del ferro con i processi di citoproliferazione ed apoptosi riscontrati in pazienti con epatopatia alcolica, e di paragonarli con quelli ottenuti in pazienti con epatopatie virali.
Nei 55 pazienti studiati, suddivisi in 10 con epatopatia alcolica (EC), 34 con epatite cronica HCV-correlata (HCV) ed 11 con epatite cronica HBV-correlata (HBV) sono stati studiati i livelli di: ferritina sierica, ferro tissutale (assorbimento atomico), cisteina, glutatione ridotto/ossidato (HPLC), malondialdeide (fluorimetria); e, parallelamente, l'istologia con la proliferazione epatocellulare (anticorpo monoclonale Ki67) e l'indice apoptotico (ISEL).
I livelli di ferritina e di ferro non differiscono tra i pazienti con EC ed HCV, anche se entrambi risultano significativamente più elevati rispetto ai pazienti con HBV (p<0,05). La malondialdeide, e quindi la perossidazione lipidica, è significativamente più elevata nei pazienti con EC e con HCV rispetto a quelli con epatite cronica HBV (p<0,0001 e p<0,05) e correla con il ferro tissutale (r=0,597, p<0,0001) e la ferritina sierica (r=0,437, p<0,05). I livelli di glutatione sono significativamente inferiori nei pazienti con EC rispetto a quelli riscontrati in pazienti con HCV ed HBV (p<0,05), mentre la cisteina risulta più elevata (p<0,05). L'indice apoptotico è leggermente più basso nei pazienti con EC, con apoptosi più frequentemente evidenziabile nell'area centrolobulare, e meno epatociti proliferanti, sia complessivamente (p<0,02) che nelle due differenti aree. In conclusione, quindi, questo studio conferma che il consumo cronico di alcol:

  1. induce danno perossidativo più rilevante, correlato con l'accumulo di ferro tissutale;

  2. riduce le difese anti-ossidanti, abbassando la disponibilità di glutatione epatico;

  3. induce un accumulo di cisteina, precursore/metabolita del glutatione a livello epatico, probabilmente per induzione della gGT;

  4. correla con una meno evidente e differente distribuzione della proliferazione ed apoptosi rispetto a quanto riscontrato nel danno virale.

Questi risultati possono spiegare il diverso tipo di cirrosi che deriva dal danno epatico alcolico ed il più basso rischio di sviluppo di cancro.

 

Introduzione

Il consumo cronico di alcol determina a livello epatico alterazioni metaboliche e patologiche, documentate sia nell'uomo che in modelli sperimentali (1,2). Queste alterazioni sono in generale associate al processo di ossidazione dell'alcol e più in particolare allo stress ossidativo che deriva dal cambiamento dello stato redox cellulare e/o dall'induzione della via microsomiale coinvolgente il citocromo P450E2 (3). Questi processi comportano come conseguenze un'eccessiva produzione di acetaldeide, formazione di addotti a livello di proteine cellulari, inattivazione di alcuni enzimi, interferenza con i meccanismi di riparazione del DNA, deplezione di sistemi antiossidanti, primo tra tutti il glutatione, produzione di radicali liberi e conseguente perossidazione lipidica (4).
Il consumo di alcol è anche considerato uno dei fattori epidemiologicamente legati ad un più elevato rischio di sviluppo di cancro (2, 5, 6). Numerosi sono i meccanismi proposti per spiegare questa correlazione: l'induzione di cirrosi, l'effetto solvente dell'alcol, l'esposizione a carcinogeni contenuti nelle bevande alcoliche, le deficienze alimentari ed immunologiche, ed infine un potenziale effetto dell'alcol stesso come co-carcinogeno nelle fasi del processo di carcinogenesi (2, 7-10). L'attività co-carcinogenetica dell'etanolo può essere mediata dalla sua capacità di aumentare l'attivazione di carcinogeni ambientali attraverso il sistema MEOS, con interferenza con i meccanismi di riparazione del DNA, dati già dimostrati in un nostro precedente studio (11).
Meno noto è l'aspetto relativo alle possibili alterazioni del turnover cellulare conseguente ad abuso alcolico, che insieme allo stress ossidativo può svolgere un ruolo rilevante nel processo carcinogenetico. Alcuni Autori hanno riportato una maggiore evidenza dei processi apoptotici ed alterazione nella proliferazione cellulare a livello epatico in pazienti con abuso alcolico (12-14), anche se, in particolare per quanto riguarda l'apoptosi, i meccanismi molecolari coinvolti non sono ancora del tutto noti. Inoltre, tali dati erano relativi alla sola patologia alcolica, non confrontati con epatopatie croniche di differente eziologia.
Sulla base di queste considerazioni, lo studio nasce dall'esigenza di descrivere in pazienti con epatopatia cronica alcol-correlata, il processo di perossidazione lipidica, le difese antiossidanti, il metabolismo del ferro, noto co-fattore in alcune reazioni legate a produzione di radicali liberi, in relazione ai processi di apoptosi e di citoproliferazione, confrontando tali aspetti con pazienti affetti da epatopatia cronica HCV ed HBV correlata.

 

Pazienti e metodi

Lo studio è stato eseguito in 55 pazienti (33 maschi e 22 femmine, con età media di 47 anni, range 20-67) che sulla base dell'esame istologico sono stati suddivisi in:

I marcatori sierici per HBV ed anti-HDV sono stati testati mediante metodica RIA; L'HBV-DNA è stato testato con metodica di ibridazione a fase-liquida, commercialmente disponibile. Tutti i pazienti HBsAg-positivi erano antiHBe/HBV-DNA positivi e nessuno presentava positività sierica per anti-HDV. L'anti-HCV è stato testato mediante ELISA e tutti i sieri positivi sono stati confermati con metodica RIBA II.
Tutti i pazienti inclusi nello studio sono stati sottoposti a biopsia epatica della quale almeno 2 cm venivano utilizzati per l'analisi istologica che comprendeva oltre alla diagnosi, la presenza di steatosi, siderosi, infiammazione totale, portale e lobulare (indicate con uno score semi-quantitativo 0-3), e la rimanente parte, di solito di circa altri 1.5-2 cm, veniva immediatamente congelata a -80°C ed utilizzata dopo breve tempo per le determinazioni biochimiche previste dallo studio. Le concentrazioni di ferro tissutale sono state determinate mediante spettroscopia di assorbimento atomico (15) ed espresse in mmoli/gr di tessuto.
La concentrazione tissutale di Malondialdeide (MDA), prodotto della perossidazione lipidica, è stata calcolata mediante il metodo proposto da Masugi (16), parzialmente modificato. Questo metodo si basa sulla reazione della MDA con l'acido tiobarbiturico con la formazione di un composto colorato, identificabile mediante fluorimetria. I livelli di MDA sono stati espressi in nmoli/gr di tessuto.
Per quanto riguarda la valutazione dei sistemi antiossidanti, i livelli di glutatione ridotto/ossidato (GSH/GSSG) e di cisteina (CYSH) sono stati determinati mediante HPLC dopo che il surnatante ottenuto dalla biopsia epatica è stato sottoposto alla procedura di derivatizzazione descritta da Reed et al. (17). I livelli tessutali di questi composti sono stati espressi in nmoli/mg di tessuto.
L'indice apoptotico, calcolato sia in zona periportale che centrolobulare, è stato valutato mediante metodica ISEL (In Situ End Labeling) (18) ed espresso come numero di cellule ISEL positive (+) su 1000, contando almeno 2000 cellule per sezione.
L'indice proliferativo, valutato in sede periportale e centrolobulare, è stato calcolato mediante l'utilizzo dell'anticorpo monoclonale Ki67 (19) ed espresso come numero di cellule MIB-1 marcate su 1000 epatociti contati.

 

Risultati

I dati ottenuti dalla valutazione degli indici di danno tissutale mediato dalla produzione di radicali liberi hanno evidenziato risultati simili nei gruppi di pazienti con EC ed HCV, con livelli significativamente più elevati di MDA, e quindi di danno perossidativo, in questi due gruppi rispetto ai pazienti con HBV. I livelli di MDA si correlano sia con il ferro tissutale (r=0,597, p<0,0001) che con la ferritina sierica (r=0,437, p<0,05), parametri anch'essi più elevati nei pazienti con EC ed HCV rispetto agli HBV (Tabella 1).

Tabella 1

Ferritina sierica, ferro tissutale e livelli di MDA tissutali (media ± DS)
 Eziologia

 Ferritina sierica
mg/l

Ferro tissutale mmoli/g tessuto
MDA
Nmoli/g tessuto
   EC
270 ± 116
18,9 ± 10
101 ± 53
   HCV
184 ± 113
14,7 ± 13
92 ± 51
   HBV
140 ± 86
5,6 ± 2,5
57 ± 11
 EC e HCV vs HBV: Ferritina e Ferro p<0,05 ANOVA one-way
 EC vs HCV: MDA p<0,0001 Student t test
 HCV vs HBV: MDA p<0,05 Student t test

 

Il grado di steatosi non differisce statisticamente nei tre gruppi di pazienti, anche se si osserva un trend verso livelli più elevati nei pazienti con EC ed HCV, mentre solo la siderosi a livello delle cellule di Kupffer è maggiormente rappresentata nel gruppo di pazienti con EC rispetto ai pazienti con epatopatia virale (p<0,0005).
Le concentrazioni tissutali di GSH risultano significativamente ridotte nei pazienti epatopatia alcolica e più elevate nei pazienti con HCV, mentre i livelli di CYSH sono significativamente più elevati nei pazienti con epatopatia alcolica. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata riscontrata nei livelli di GSSG tissutali (Tabella 2).

Tabella 2

GSH, GSSG e CYSH nei 3 gruppi di pazienti (media ± DS)
 Eziologia

GSH
Nmoli/mg tessuto

GSSG
Nmoli/mg tessuto
CYSH
Nmoli/mg tessuto
   EC
0,8 ± 0,5
0,13 ± 0,01
1,2 ± 0,3
   HCV
2,2 ± 0,8
0,2 ± 0,1
0,7 ± 0,6
   HBV
1,4 ± 0,7
0,1 ± 0,02
0,5 ± 0,2
 EC vs HCV e HBV: GSH p<0,05 ANOVA one-way
 EC vs HCV e HBV: CYSH p<0,05 ANOVA one-way

 

L'indice apoptotico e quello citoproliferativo risultano più bassi nei pazienti con EC rispetto agli altri gruppi, anche se la differenza non raggiunge la significatività statistica nel caso dell'apoptosi. Confrontando il gruppo ad eziologia virale, HCV ed HBV presentano indici di apoptosi più elevati rispetto a quanto riscontrato nei pazienti con epatopatia alcolica (Tabella 3).

 

Tabella 3

Apoptosi epatocellulare e citoproliferazione nei 3 gruppi di pazienti (media ± DS)
 Eziologia

Indice di apoptosi
(ISEL + cellule/1000)

Epatociti proliferanti
(MIB-1 cellule/1000)
   EC
7,1 ± 6,7
1,4 ± 0,5
   HCV
10,6 ± 6,7
3,2 ± 2,0
   HBV
13,8 ± 6,9
2,3 ± 1,5
 Epatociti proliferanti: EC vs HCV e HBV p< 0,02 ANOVA one-way

 

Considerando l'apoptosi e la citoproliferazione separatamente a livello dell'area periportale (zona 1) e centrolobulare (zone 2-3) abbiamo ottenuto che i pazienti con epatopatia alcolica presentano più frequentemente cellule apoptotiche nell'area centrolobulare (60%), mentre l'opposto è vero per i pazienti con danno HCV- (32%) ed HBV-correlato (36%) e che i pazienti con danno alcolico presentano meno frequentemente citoproliferazione nelle zone 2 e 3 (15% dei casi) rispetto ai pazienti HCV (50%) (HBV = 18%).

 

Discussione

È ormai noto che numerose sono le vie attraverso le quali l'alcol ed i suoi metaboliti possono contribuire al danno epatocellulare ed uno degli aspetti della tossicità esercitata dall'etanolo maggiormente studiato in questi ultimi anni, è il contributo dei radicali liberi nella patogenesi del danno epatico (20, 21). A conferma di questo, sia tecniche sempre più sofisticate, quali la risonanza di spin elettronico (ESR) (22), sia studi indiretti, hanno dimostrato aumentata formazione di radicali liberi e di prodotti della perossidazione lipidica, quali lipoperossidi, dieni coniugati e MDA, sia in seguito a consumo acuto che cronico di alcol nell'uomo ed in modelli sperimentali (23, 24). La relazione tra danno ossidativo ed insorgenza di danno epatico è supportato anche da analisi immunoistochimiche che hanno dimostrato la presenza di aldeidi derivate dalla perossidazione lipidica nelle aree di infiltrazione grassa, fibrosi e necrosi focale (25).
Ma mentre alcuni meccanismi di danno epatico, come lo stress ossidativo, sono stati ampiamente studiati, poco è conosciuto su altri possibili meccanismi, quali l'apoptosi e la citoproliferazione, come già riportato nell'introduzione.
Sulla base di queste considerazioni, lo scopo dello studio è valutare i parametri relativi al danno cellulare alcol-indotto, confrontando i risultati ottenuti in pazienti con epatopatia alcolica rispetto a quanto osservato in pazienti con epatopatia virale, pur non analizzando i meccanismi molecolari che stanno alla base di questi processi.
Questo studio ha confermato il ruolo del danno mediato dalla produzione di radicali liberi nelle epatopatie alcoliche. La determinazione dei livelli di MDA, indice di danno perossidativo, può essere considerata come un primo ed indiretto approccio che permette di valutare la produzione di radicali liberi in studi sia clinici che sperimentali. Dai risultati ottenuti dalla valutazione di questo parametro è risultato, infatti, che la perossidazione lipidica è presente nelle epatopatie alcoliche in parallelo ad una riduzione della disponibilità di sostanze scavanger, quali il GSH. Quest'ultimo risultato indica una progressiva diminuzione della capacità del fegato a provvedere ad una adeguata difesa verso l'aumentata produzione di radicali liberi, peggiorata dalla possibile associazione con accumulo di cisteina epatica, precursore/metabolita del glutatione. Questa condizione probabilmente deriva da aumentato catabolismo del GSH, anche dovuto ad un'induzione della g-glutamil-transpeptidasi (enzima coinvolto nel catabolismo del GSH), come dimostrato dallo studio dei livelli di cisteina a livello eritrocitario (26).
In aggiunta, sempre nei pazienti con epatopatia alcolica, è stato documentato anche accumulo di ferro tissutale e di ferritina sierica, peraltro simile a quello riscontrato nei pazienti con danno HCV-mediato, correlato con la perossidazione lipidica. In studi precedenti in epatopatie HCV-correlate, il nostro gruppo aveva dimostrato che il danno ossidativo epatico, accompagnato da accumulo di ferro, è legato anche ad incremento di danno al DNA, aspetto che sembra verosimilmente importante nel processo di carcinogenesi (27), eventualmente anche in quella alcol-mediata. In generale, quindi, il tipo di danno epatocellulare riscontrato nelle epatiti croniche HCV-correlate per molti aspetti richiama quanto dimostrato nelle epatopatie alcol-correlate. Al contrario, i livelli di GSH e CYSH risultano rispettivamente marcatamente più bassi e più alti nell'epatopatie alcol-correlate rispetto alle forme virali, fatto che suggerisce l'importanza del danno ossidativo in entrambi le condizioni, a differenza di quanto avviene nell'epatopatie HBV-correlate nelle quali i meccanismi di danno sono del tutto diversi.
Per quanto riguarda i meccanismi di apoptosi e citoproliferazione, fattori altrettanto importanti nella fisiopatologia epatica ed in particolare nei meccanismi di carcinogenesi, i nostri dati dimostrano che nelle epatopatie alcoliche entrambi i processi sono meno evidenti rispetto a quanto si verifica nelle epatopatie virali. Ma mentre per la citoproliferazione i nostri dati sono in accordo con i risultati di altri lavori presenti in letteratura (14), più discordanti risultano quelli relativi all'apoptosi, anche se vi è il limite del mancato confronto con patologie ad altra eziologia (12, 13)
Infine, a conferma di una diversa fisiopatologia del processo di turn-over cellulare nell'epatopatia alcolica, la distribuzione delle cellule proliferanti ed apoptotiche risulta molto differente nel danno alcol-correlato rispetto a quello virale. In particolare, nell'epatopatia alcolica le cellule in apoptosi sono più frequentemente riscontrabili nell'area perivenulare, dove, come noto, l'alcol esercita la sua azione tossica (1), mentre gli epatociti proliferanti sono osservati maggiormente nell'area periportale, sito per così dire più "fisiologico", di quanto si osservi nel caso di danno HCV-correlato.
In conclusione, quindi, sulla base dei dati che evidenziano come in corso di epatopatia alcol-correlata il danno ossidativo è più rilevante mentre le alterazioni del turnover cellulare sono meno evidenti rispetto a quanto si verifichi nei pazienti con epatopatia cronica virale, si può ipotizzare che il ruolo del danno ossidativo nel modulare il turnover cellulare è più limitato di quanto atteso sulla base dei dati riportati in letteratura e che quest'ultimo coinvolge differenti aree funzionali epatiche. Se questi aspetti possano svolgere un ruolo importante in relazione alla differente prognosi della patologia alcolica e nel determinare il più basso rischio neoplastico riscontrato nei pazienti con danno cronico alcol-correlato è sicuramente un aspetto importante da valutarsi.

 

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